CRISPR動物基因組工程廣泛應用于研究中，該方法包括三個主要步驟：受精卵的分離，顯微注射，以及將顯微注射的受精卵轉移到假懷孕雌性的輸卵管中。這些步驟要求技術人員具備非常高的專業素質，以及昂貴的配套設備。

2015年GONAD技術應運而生，首次證明了可直接在輸卵管上對受精卵進行原位電穿孔，生產基因組編輯小鼠，成功簡化了CRISPR動物基因組工程的三大步驟。注入輸卵管腔內的外源基因組編輯組分被整合到2細胞胚胎中，基因組在目標位點被編輯。這種技術被命名為“通過輸卵管核酸輸送進行基因編輯”，也就是GONAD技術。使用GONAD技術，可以在不需要離體處理胚胎的情況下進行CRISPR / Cas9介導的靶向基因組編輯。

在此基礎上，來自日本東海大學的Dr. Ohtsuka借助日本BEX公司CUY21EDIT II電轉化儀又發明了一種i-GONAD技術（東海大學和BEX公司共同申請專利），i-GONAD是GONAD的升級版。采用CUY21 EDIT II電轉儀導入CRISPR RNPs：Cas9蛋白/Cpf1蛋白和gRNA到第0.7天孕鼠體內。i-GONAD技術比受精卵電穿孔和顯微注射操作更便捷，比GONAD技術更高效（基因編輯效率，GONAD約為25%，i-GONAD約為97%），使得動物基因組工程技術能夠在更多的實驗室中進行。

i-GONAD的發明者Dr. Ohtsuka在文章中著重推薦了CUY21 EDIT II的恒流電轉模式，恒流對于實驗獲得可重復性有著重要的作用。每只老鼠的肥胖率因個體而異，而且每次實驗中輸卵管周圍的環境也不同，如電極的距離、PBS在輸卵管中的浸泡情況等，這些問題都會導致阻抗（電阻）的變化，即使使用的電壓相同，電流也會因為阻抗的變化而變化。我們都知道，電流會在細胞表面造成損傷和孔洞，電流過大會導致細胞死亡，具有恒流模式的電轉儀可以更好的保護細胞。

1、準備CRISPR試劑：

設計crRNA

準備DNA模板

2、i-GONAD實驗步驟：

準備懷孕的雌鼠

準備基因編輯試劑溶液

手術暴露輸卵管和注射

體內電轉

3、分析步驟：

基因編輯評估

圖2. 體內電穿孔示意圖

圖3. i-GONAD程序所需的設備和儀器

a.i-GONAD方法所需的主要儀器和材料

b.i-GONAD方法所需的手術器械和材料

c.體式顯微鏡

d.電轉儀（BEX, cat. no. CUY21 EDIT II）和電極（BEX, cat. no. LF650P3）

整個i-GONAD流程不需要分離受精卵以及精密的顯微注射步驟，只需一些常用的手術器械以及CUY21 EDIT II電轉儀即可完成。

此外，根據Ohtsuka和Gurumurthy等人的說法， i-GONAD/ GONAD 常用于雜交小鼠，如B6C3F1（C57BL / 6和C3H / He之間的雜交種）和ICR小鼠，而不是近交系C57BL / 6（B6）小鼠，且發現用于雜交小鼠和ICR小鼠的電轉條件對B6胚胎的發育有害。Ohtsuka等人證明，使用BEX CUY21 EDIT II電轉儀應用恒流模式進行i-GONAD時，可成功獲得基因編輯的B6后代。可見，恒流模式對于細胞更具有保護作用。

CUY21 EDIT Ⅱ多模式高效基因電轉化儀，可將外源基因高效導入到原代細胞等難轉染細胞、細胞系、受精卵、動物組織或器官中，不依賴于特殊的轉染試劑即可實現高效轉染，是一款真正的多模式，全功能基因電轉化儀。

參考文獻

[1]Ohtsuka, M., Sato, M., Miura, H. et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biol 19, 25 (2018).

[2]Kobayashi Y, Aoshima T, Ito R, Shinmura R, Ohtsuka M, Akasaka E, Sato M, Takabayashi S. Modification of i-GONAD Suitable for Production of Genome-Edited C57BL/6 Inbred Mouse Strain. Cells. 2020 Apr 13;9(4):957. 

[3]Gurumurthy,C.B.,Sato,M.,Nakamura,A. et al. Creation of CRISPR-based germline-genome- engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nat Protoc 14, 2452–2482 (2019).